差异脲原体PCR检测试剂盒

差异脲原体（Ureaplasma Diversum）1969年*被分离出来，最初被定义为非致病性物种，但是最近已证明它会对牛组织细胞和器官造成损伤。 差异脲原体常见于牛的生殖道，与这些动物的主要生殖器官疾病有关。受感染的母牛可能出现不孕、胎盘炎、胎牛肺泡炎和流产或弱小犊牛出生的现象，而在公牛中它可能导致精子活力低下、精囊炎和附睾炎。尽管如此，差异脲原体和牛生殖异常之间的关系仍然存在争议，主要是因为在正常繁殖的动物中也有高比例的阳性检出率。差异脲原体是一种兼性细胞内微生物，既可以在细胞内检测到，也可以粘附在细胞表面。它对牛精子的侵入与精子活力低有关，表明它可能导致这些细胞的死亡。它也能诱导实验感染小鼠的子宫产生TNF-α，表明它可能显著改变子宫微环境的稳态。差异脲原体对这些细胞和组织发挥毒力和致病性的分子机制大多是未知的。

体外培养法和PCR法均可用于检测差异脲原体。体外培养法是经典的检测方法，但耗时较长，而使用PCR法则有灵敏度高和特异性强的优点，且检测时间短，仅需几个小时即可获得结果。

差异脲原体PCR检测试剂盒选取了16S rRNA基因的一段序列进行PCR鉴定，引物经BLAST验证为特异性靶向差异脲原体，与其他生物的基因组无交叉反应。使用本试剂盒检测了5种牛寄生性支原体，仅有差异脲原体产生特异性扩增条带；而对168个生殖异常牛的阴道拭子检测的结果显示，有64个呈阳性，灵敏度高于体外培养法。可见本试剂盒具有物种特异性，可用于差异脲原体的鉴定和检测。

差异脲原体PCR检测试剂盒【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

组织：取50mg左右组织用玻璃匀浆器匀浆，匀浆后置入洁净的1.5ml离心管中；
液体标本：取适量标本13000rpm离心2min，弃上清。
1.2 DNA提取

1) 对上述处理好的标本加入40ul 核酸提取液，100℃恒温处理10分钟，13,000 rpm离心5分钟，取上清液转移至新的1.5ml EP管，-20℃保存；
2. 试剂配制（试剂准备区）

根据代检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1

管阴性对照+1管阳性对照），体系配制如下表：

试剂

WSSV 反应液

酶液

用量（样本数为N）

20μl

1μl

3. 加样（样本处理区）

将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μl，加入相应的

反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；

5. 结果分析判定

差异脲原体PCR检测试剂盒结果分析条件设定
设置基线（baseline）：一般情况下，对ABI 7500、7700等仪器设为6-15cycle，对PE5700设为3-15cycle,对MJ Research Option2设为6-12cycle。特殊情况可对基线适当调整。
设置阈值（threshold）:以阈值线刚超过阴性对照扩增曲线（无规则的噪音线）的zui高点。
结果判断
阳性：检测样本Ct值小于等于35.0，且曲线有明显的指数增长期；
可疑：检测样本Ct值大于35.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；
阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40。

试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。.