- 上海沪峥生物科技有限公司
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- 品牌:上海沪峥
- 产地:国内
- 型号:50T/盒
- 货号:HZW6543
- 价格: ¥2680/盒
- 发布日期: 2021-02-19
- 更新日期: 2024-11-08
产地 | 国内 |
品牌 | 上海沪峥 |
货号 | HZW6543 |
用途 | 仅用科研 |
包装规格 | 50T/盒 |
【产品名称】
商品名称:新城疫病毒中强毒(NDV-W)检测试剂盒(荧光-PCR法)
【包装规格】50 份/盒
【预期用途】
本试剂盒适用于检测的血清或血浆、疑似污染 NDV-W 的活病
毒疫苗等标本中禽网状内皮组织增殖病病毒 RNA,适用于禽网状内皮组织增殖病病
毒感染的辅助诊断。其检测结果仅供参考。
新城疫病毒中强毒(NDV-W)检测试剂盒(荧光-PCR法)【检验原理】
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
水样便取 0.5~1mL;疑似污染的食物取 1g
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输,严禁反复冻融。
【使用方法】
1. 样品处理(样本处理区)
1.1 样本前处理
水样便 13000rpm 离心 2min,去尽上清;疑似污染的食物用手术剪剪碎混匀后取0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中;疑似污染的水直接取 100μL
1.2 DNA 提取
1) DNA 的提取也可以采用DNA 提取试剂盒(离心柱提取法),请严格按照试剂盒说明书进行操作。
本试剂盒用一对禽网状内皮组织增殖病病毒特异性引物,结合一条特异性荧光
探针,用一步法荧光 RT-PCR 技术对禽网状内皮组织增殖病病毒 RNA 进行体外扩
增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
【试剂组成】
名 称 规 格
酶液 50μl×1 管
REV 反应液 1.0ml×1 管
REV 阳性质控品 50μl ×1 管
阴性质控品 250μl ×1 管
说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
新城疫病毒中强毒(NDV-W)检测试剂盒(荧光-PCR法)结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
1.2 结果判断
阳性:检测通道 Ct 值≤35,且曲线有明显的指数增长曲线;
可疑:检测通道 35
阴性:样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
2. 质控标准
阴性质控品:Ct 值>38 或无 Ct 值;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
反应五要素:
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则:
①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。
②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC*随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基,特别是最末及倒数 个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列*有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以*引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
【注意事项】
? 所有操作严格按照说明书进行;
? 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;
? 反应液应避光保存;
? 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
? 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
? 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
? 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
? 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通 则》进行处理。