本试剂盒用一对西部马脑炎病毒(WEE)核酸检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)

特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对西部马脑炎病毒(WEE)进行体外扩增检测，用于对可疑感染者的病原学诊断。 

【储存条件及有效期】

-20℃避光保存、运输、避免反复冻融，有效期12个月。

【适用仪器】

ABI系列、MJ系列、Roche系列、博日系列及其他荧光定量PCR检测仪。
【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

组织：取50mg左右组织用玻璃匀浆器匀浆，匀浆后置入洁净的1.5ml离心管中；
液体标本：取适量标本13000rpm离心2min，弃上清。
1.2 DNA提取

1) 对上述处理好的标本加入40ul 核酸提取液，100℃恒温处理10分钟，13,000 rpm离心5分钟，取上清液转移至新的1.5ml EP管，-20℃保存；
2. 试剂配制（试剂准备区）

根据代检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1

管阴性对照+1管阳性对照），体系配制如下表：

试剂

WSSV 反应液

酶液

用量（样本数为N）

20μl

1μl

3. 加样（样本处理区）

将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μl，加入相应的

反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；

5. 结果分析判定

结果分析条件设定
设置基线（baseline）：一般情况下，对ABI 7500、7700等仪器设为6-15cycle，对PE5700设为3-15cycle,对MJ Research Option2设为6-12cycle。特殊情况可对基线适当调整。
设置阈值（threshold）:以阈值线刚超过阴性对照扩增曲线（无规则的噪音线）的zui高点。
结果判断
阳性：检测样本Ct值小于等于35.0，且曲线有明显的指数增长期；
可疑：检测样本Ct值大于35.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；
阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40。
6. 对检验结果的解析

实验室环境污染，试剂污染，标本交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果。

7. 质控标准

阴性质控品：扩增曲线无对数生长期或无Ct值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显对数生长期，且Ct值≤32;
以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

【注意事项】

所有操作严格按照说明书进行；
试剂盒内各种组分使用前应自然融化，混匀并短暂离心；
反应液应避光保存；
反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。.