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细胞表面抗原染色

细胞表面抗原染色

发布时间:2020-09-22

细胞表面分子流式检测步骤说明注意事项

1. 在使用抗体之前,快速甩动一下,使之聚集到管的底部;

2. 荧光标记的抗体应该避光保存在4℃,不要冷冻;

3. 当染色的时候,固定或延迟分析可能降低某些抗体的荧光信号。为了得到更好的结果,染色后应该马上分析。

过程概述:

1. 制作外周血、淋巴组织或者培养细胞的单细胞悬液;

2. 细胞染色抗体(包括直接标记抗体和间接标记抗体);

3. 洗涤步骤弃掉所有的为束缚的试剂

4. 运行分析流式仪。

注意:流式细胞染色实验中,所有实验条件的优化都很重要。关键参数包括靶细胞、抗体效价以及动力学。

试验A:小鼠淋巴细胞悬液的免疫荧光染色

材料:12×75 mm的圆底试管(Falcon Cat.No.2008)或96孔圆底微量滴定板(Falcon Cat.No.3910),原始抗体(既未纯化也未偶联),

缓冲液: eBioscience流式染色缓冲液(Cat.No.00-4222),流式鞘液

仪器:移液管和移液器,离心机,冰柜或冰箱,流式仪

试验时间

半个小时细胞准备,半个小时抗体稀释和样品准备,半个小时到一个小时孵育过程,半个小时以上的运行和分析时间

方法细胞准备:

1. 采集组织(脾,淋巴结,胸腺),用注射器的活塞挤压以制成单细胞悬液,此过程用10ml的染色缓冲液;

2. 转移到50ml的圆锥形试管中并使大块沉淀到试管底部或者通过尼龙滤网过滤,得到单细胞悬液;

3. 4℃ 离心沉淀细胞悬液4-5分钟(300-400g),弃掉上清;

4. 如果上过程采集的脾,还用用RBC裂解,否则进入下一步;

5. 用50ml染色液重悬样本,进行细胞计数和活力分析;

6. 再次离心细胞,弃掉上清,重悬细胞使其细胞数达到2×107 个/ml;



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